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光遺傳學(xué)技術(shù)在腦疾病神經(jīng)環(huán)路研究中的應(yīng)用(1)
點擊次數(shù):1949 更新時間:2021-04-19

1、光遺傳學(xué)(optogenetics)技術(shù)

1.1 光遺傳學(xué)技術(shù) 腦科學(xué)研究工具的基本功能是記錄神經(jīng)元的活動與調(diào)控。隨著成像技術(shù)的發(fā)展,神經(jīng)活動記錄目前已經(jīng)實現(xiàn)了從宏觀記錄到微觀記錄的演變,功能磁共振成像 (functional MRI,fMRI)、正電子成像 (positron emission tomography, PET)、腦電圖 (electroencephalography,EEG)、神經(jīng)元鈣成像技術(shù) (calcium imaging) 等可以在不同微觀層面上顯示神經(jīng)元活動,單光子及雙光子顯微鏡的出現(xiàn)使得對神經(jīng)元的觀察可以細致到單個神經(jīng)元甚至是細胞亞結(jié)構(gòu)如突觸水平。在神經(jīng)元調(diào)控層面, 傳統(tǒng)的調(diào)控方式包括細胞外電生理刺激、藥物干預(yù)和基因編輯,等。電刺激是Z常用的神經(jīng)元調(diào)控手段, 具有較高的時間準確性,但細胞特異性低。其他方式如藥物干預(yù)或者基因編輯,可以精que到特殊類型細胞,但時間分辨率較低。因此,早期的腦功能研究工具尚不能兼顧高時間分辨率、高空間分辨率和細胞類型高分辨率。理想的腦科學(xué)研究工具需要兼顧這 3 種分辨率需求,特別是目前對于腦功能連接網(wǎng)絡(luò)的研究,急需單個神經(jīng)元和神經(jīng)纖維分辨率下的神經(jīng)元群體的長期調(diào)控與觀察,這就需要突破現(xiàn)有腦功能研究工具的技術(shù)瓶頸。

光遺傳學(xué)是將遺傳學(xué)與光學(xué)相結(jié)合的新技術(shù),使用遺傳學(xué)手段,常以病毒或者使用轉(zhuǎn)基因動物為載體, 將光敏蛋白基因?qū)氲侥繕思毎校毎磉_光敏感蛋白,之后利用光學(xué)調(diào)控細胞活動,光遺傳學(xué)的本質(zhì)是將遺傳學(xué)與光學(xué)方法相結(jié)合從而使活體中特定細胞獲得或失去特定的功能。

光遺傳學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展實現(xiàn)了神經(jīng)科學(xué)家用光照控制神經(jīng)元活動的設(shè)想,結(jié)合成像等輔助技術(shù), 具有高時間特異性、高空間特異性以及高細胞類型特異性進行神經(jīng)元調(diào)控的特性,從各個層面上進行腦科學(xué)研究 。

1.2 光遺傳學(xué)技術(shù)的原理與應(yīng)用方法   光遺傳學(xué)技術(shù)是遺傳學(xué)與光學(xué)技術(shù)的結(jié)合,利用遺傳學(xué)手段, 將光敏感蛋白導(dǎo)入至目標細胞中,之后利用光學(xué)手段刺激目標細胞從而實現(xiàn)細胞功能的控制。光遺傳學(xué)技術(shù)的 6個簡要步驟。

首先是在目標神經(jīng)元中表達光敏蛋白 —— 視蛋白。視蛋白是光遺傳學(xué)中使用z廣泛的執(zhí)行元件, 是光敏感膜蛋白在受到特定頻率的光線照射后可以實現(xiàn)暫時的構(gòu)象變化、執(zhí)行功能。根據(jù)視蛋白種類的不同,可以實現(xiàn)神經(jīng)元的激活或者抑制。實現(xiàn)光敏蛋白在目標細胞的表達:

①構(gòu)建遺傳學(xué)元件。

② 選用合適的載體將遺傳學(xué)元件導(dǎo)入目的細胞進行基因改造,常用由病毒、轉(zhuǎn)基因動物或者兩者相結(jié)合的方式來實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)基因動物結(jié)合病毒載體注射的方式可以更好的實現(xiàn)光敏蛋白表達的細胞類型與空間特異性,是目前z廣泛使用的方法,比如 Cre 重組酶小鼠結(jié)合病毒載體導(dǎo)入。

③將構(gòu)建好的病毒載體注射到目的腦區(qū)使其在目標神經(jīng)元表達。這些基因產(chǎn)物感應(yīng)光照后,產(chǎn)生相應(yīng)的構(gòu)象改變,作為光敏感離子通道或離子泵等工作元件而發(fā)揮作用,發(fā)揮蛋白功能、調(diào)控細胞活動 。

④光源調(diào)控元件植入目標部位。常用的“光電極”是光纖結(jié)合電極將光源的傳遞與電生理記錄整合到一個裝置中,從而實現(xiàn)在使用光源控制神經(jīng)元活動的同時進行神經(jīng)活動的電生理記錄。

⑤選擇特定波長的光源進行目標細胞的活動干預(yù),常用的光源有激光、發(fā)光二極管 (light-emitting diodes,LED)。激光光源優(yōu)勢在于可以使用波段較短的光,實現(xiàn)不同類型視蛋白的控制,并且可以與光纖有效結(jié)合,便于腦深部的光源導(dǎo)入,腦損傷較小。LED 優(yōu)勢在于價錢更低,以及具有較多的光源顏色的選擇,可以實現(xiàn)多位點發(fā)光以及制作成無線移動裝置 。⑥實驗過程中輸出數(shù)據(jù)的讀取與分析,涉及到光遺傳學(xué)各種輔助技術(shù)的快速發(fā)展。

摘要 光遺傳學(xué)廣義上是借助光感靶向控制工具向效應(yīng)細胞傳遞不同功能的研究工具。在神經(jīng)科學(xué)研究中,科學(xué)家可以利用光學(xué)手段調(diào)控特定神經(jīng)元亞群(甚至單個神經(jīng)元)的電活動,研究生理和病理情況下神經(jīng)環(huán)路的功能和潛在調(diào)控機制。光遺傳結(jié)合鈣離子成像技術(shù),可以在生理調(diào)控的基礎(chǔ)上實現(xiàn)實時觀測神經(jīng)元的響應(yīng)活動,有助于從多個維度定位特定功能的神經(jīng)元集群,進一步揭示其在神經(jīng)環(huán)路中的具體作用,用于解釋腦疾病對整體腦功能網(wǎng)絡(luò)的影響,幫助臨床醫(yī)生更好地理解帕金森病、阿爾茨海默病、癲 等神經(jīng)環(huán)路疾病的發(fā)病機制,找到潛在的治療靶點,改善患者的臨床預(yù)后。

光遺傳學(xué)技術(shù)可以與多種數(shù)據(jù)讀取方式相結(jié)合。電生理信號的讀取是Z常用的方式之一,如光電極, 可以在自由活動動物身上實現(xiàn)多個位點的電生理記錄,具有較高的時間與空間分辨率,但是細胞類型分辨率較低。采用fMRI 可以從宏觀上對于腦功能的變化進行提示,也是數(shù)據(jù)讀取方式之一,但其時間、空間、細胞類型分辨率都較低。光學(xué)信號讀取具有更好的空間分辨率以及細胞類型信息。基于染料的成像已經(jīng)用于各種光遺傳學(xué)研究,使用鈣離子染料、電壓敏感染料可以實現(xiàn)神經(jīng)元活動的可視化 。神經(jīng)元鈣成像是近年來快速發(fā)展的光遺傳學(xué)數(shù)據(jù)讀取的有效方式。

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